|
1. Doku kültürü (Genel Bilgiler);
Dünya nüfusunun normal bir artış hızıyla 2025 yılında 8,3 milyona ve 2100 yılında ise 11 milyona ulaşacağı tahmin edilmektedir. Yani 21.yy sonunda dünyadaki mevcut kaynakların, şuandakinin iki katına yakın bir nüfusu beslemesi gerekecektir. Diğer taraftan, dünya genelinde kişi başına düşen tahıl ekim alanı 1950-1998 yılları arasında yaklaşık %50 oranında azalarak 2,3 dekardan 1,2 dekara düşmüştür. Birçok ülke açısından bu durum hiçbir sorun teşkil etmemiştir. Çünkü, verimdeki yeni artışlar tarım alanlarındaki azalmalardan kaynaklanan açığı fazlasıyla kapatmıştır. Fakat verim artış hızında 1990 yılından bu yana azalma gözlenmektedir. Kişi başına düşen besin tüketimi sabit kalsa bile, 2025 yılına kadar dünya besin üretiminde en az % 57 lik bir üretim artışı sağlanması zorunludur. İşte bu nedenlerle verimdeki artışların tarım alanlarındaki azalmadan kaynaklanan verim kaybını karşılayıp karşılayamayacağı kuşkulu olduğundan, üstün teknolojilere duyulan ihtiyaç gittikçe daha çok önem kazanmaktadır.
Bitki biyoteknolojisi çeşitli doku kültürü ve genetik mühendisliği teknikleri kullanarak bitkilerin moleküler seviyede iyileştirilmelerini amaçlamaktadır. Örneğin; bugün kültürü yapılan birçok bitki türünün ürettiği etken maddeler laboratuarda üretilmektedir. Yine tarımsal önemi olan genler değişik organizmalardan izole edilerek kültür bitkilerine kolaylıkla aktarılabilmektedirler.
Bitkilerin, biyoteknolojik yöntemlerle iyileştirilmesinde doku kültürü yöntemlerine mutlak bir ihtiyaç vardır.
1938 yılında hücrelerin tam bir bitkiyi oluşturdukları şeklindeki düşünce Totipotensi Teorisi olarak ortaya konmuştur. Bu teori hücre ve doku kültürünün başlangıcı olarak kabul edilmektedir. Bitki hormonlarının geç keşfedilmiş olması, bitki doku kültürü çalışmalarının, hayvan ve insan doku kültürü çalışmalarına göre daha geç başlamasına sebep olmuştur. İlk defa bir oksin olan IAA in keşfedilmesinden sonra bitki doku kültürü çalışmalarında çok önemli bir aşama kaydedilmiştir. 1892 yılından günümüze kadar bir çok çalışma yapılmış başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Ülkemizde bir çok üniversitede, Tübitak Araştırma Merkezinde ve Tarım bakanlığına bağlı Araştırma Enstitülerinin laboratuarında çalışmalara devam edilmektedir.
2. DOKU KÜLTÜRÜNÜN TANIMI VE AMAÇLARI
Doku Kültürü; aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku, (çeşitli bitki kısımları = eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir.
Bitki doku kültürünün amaçları; Yeni çeşit geliştirmek, mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak, kaybolmakta olan türlerin korunması, çoğaltılması zor olan türlerin üretimi şeklinde özetlenebilir.
3. DOKU KÜLTÜRÜ İŞLEMLERİNİN GERÇEKLEŞTİRİLEBİLMESİ İÇİN GEREKLİ OLAN AŞAMALAR:
Uygun bir laboratuar düzeninin kurulması, kullanılacak bitki parçalarının ve besin ortamının seçimi hazırlanması ve sterilizasyonu, kallus ve hücre süspansiyonlarının oluşturulması, kallus ve hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenarasyonun uyarılması (organogensis, somatik embriyogenesis veya meristem çoğaltım yolu ile), oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların olgunlaştırılması, uzayan sürgünlerin köklendirilmesi ve köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması şeklinde özetlenebilir.
3.1. Hazırlık Safhası
3.1.1. Sterilizasyon
Doku kültürü çalışmalarının başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için uygun bir laboratuar düzeninin kurulması, kullanılacak bitki parçalarının hazırlanması ve sterilizasyonu hazırlık safhasına girmektedir.
Sterilizasyon, bulaşmaya neden olacak bütün mikroorganizmaların öldürülmesi için kullanılır. Sterilize edilecek yer ve materyale göre 3 kısımda değerlendirilir;
1. Çalışma ortamı
2. Kullanılan aletler
3. Bitki materyali
Sterilizasyon için rutin işlem 121 0C de otoklavdır. Bitki organ ve dokusundan explant izole edilemeden önce, bitki yüzeyindeki mikroplarının elemine edilmesi gerekmektedir. Bu amaçla; kalsiyum ve sodyum hipoklorit solüsyonları, hidrojen peroksit, gümüş nitrat, cıva klorür gibi maddeler sterilant olarak kullanılmaktadır.
Bazı durumlarda izole edilen bitki parçasının
%70 lik etanol içerisine 30 sn. süre ile daldırılıp, sonradan diğer sterilant madde ile sterilize edilmesi yaralı olmaktadır.
3.1.2. Besin Ortamları
Çeşitli araştırıcılar tarafından bildirilen birçok besin ortamı formülasyonu mevcut olmasına rağmen birkaç tanesi (örnek: MJ, B5 ve L5) ve bunların çeşitli modifikasyonları çok yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bitki besin ortamlarında yer alan komponentler kullanım sıklığına göre;
Su, makro elementler, mikro elementler, vitaminler, şekerler (karbon kaynağı) yarı-katılaştırıcılar ( jel yapıcılar; agar, agaroz, vb.) bitki büyüme düzenleyicileri, tamponlar, amino asitler ve kimyasal olarak tanımlanamayanlardır. Bu komponentlerin hepsi aynı anda her ortamda bulunmayabilir.
- Makro elementler: En önemlisi azottur. Fosfor, sodyum, magnezyum kükürt ve kalsiyum da önemli elementler arasında sayılabilir.
- Mikro elementler: En çok kullanılan mikro elementler sırasıyla demir, manganez, çinko, bor, bakır, molibden, kobalt ve iyottur.
- Vitaminler: Enzim reaksiyonlarında katalitik etkiye sahiptirler. En gerekli olanlar B1, B3, B6, C, E, A ve D3 tür ve zaman zaman özel uygulamalarda besin ortamına ilave edilebilirler.
- Şekerler: Kültüre alınan bitki hücre ve dokuları yeterli miktarlarda karbonhidrat sentezi yapamadıklarından enerji kaynağı olarak çeşitli şekerler kullanılmalıdır. Besin ortamlarında sıklıkla kullanılan şeker sakkarozdur. Diğerleri; glikoz, maltoz ve früktozdur.
- Jel yapıcı maddeler: Besin ortamlarını yarı-katı hale getirmek için kullanılan komponentler arasındadır. En çok kullanılanlar; agar, agaroz, jelâtin ve nişastadır.
- Bitki büyüme düzenleyicileri: oksinler, sitokininler, gibberellinler ve absisik asittir.
Oksin: Kallus uyarımı, sürgün rejenerasyonu ve hücrelerin köklendirilmesinde kullanılır.
Stokinin: Hücre bölünmesi ve sürgün çoğaltımında kullanılır.
Gibberellin: Meristemlerden bitki rejenerasyonunun uyarılmasında, sürgünlerin boylarının uzatılmasında, embriyo ve ovül kültüründe kullanılmaktadır.
Absisik asit; Doku kültüründeki rolü tam olarak bilinmemekle beraber, genellikle somatik embriyoların olgunlaştırılmasında kullanılır.
- Amino asitler: Hücre kültürlerinin indirgen azot ihtiyacını karşılamada çok önemlidirler. Eğer ortamda nitrat ve amonyum miktarı dengeli ise birçok ortamda kullanılmaları gereksiz olabilir.
- Antibiyotik ve biyositler: Besin ortamının kirlenmesini önlemek amacıyla uzun süreli korumada biyosit, kısa süreli korumada antibiyotikler kullanılır.
- Diğer komponentler: Bazı özel durumlarda bitki hücrelerince salgılanan toksit maddeleri absorbe etmek için besin ortamlarına (özellikle köklendirme ortamlarına) aktif karbon ilave edilir.
3.2. Çoğaltım Safhası ve Alıştırma Safhası
Doku kültürü için sıcaklık ve ışık en önemli çevre faktörleridir. Eksplantın seçimi, izole edilmesi ve uygun gıda ortamına steril şartlarda yerleştirilmesi sonunda, sıcaklık ve ışığı amaca uygun olarak ayarlanmış bir ortama alınması ile hazırlık safhasından çoğaltım safhasına geçilir. İndirek veya direk yol seçilerek bitkicik elde edilmeye gidilir. Toprağa aktarma aşamasına ulaşan in vitro fideler saksılara alınırlar.
4. BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİNİN BİTKİ ISLAHINDAKİ KULLANIMI:
4.1. Embriyo kültürü:
Doğada eşeysel melezlerin elde edilmesini sınırlayan ve kısırlıkla sonuçlanan uyuşmazlıklar söz konusudur. Özellikle türler arası melezlemelerde zigot oluşumundan sonra ortaya çıkan ve endospermin kabul edilmemesi durumu olan post-zigotik uyuşmazlık adı verilen olay gözlenebilir. Böyle bir durumda embriyo beslenemez ve gelişemez. Bu embriyolar özel besin ortamlarında doku kültürü ile geliştirilmekte ve yeni melez bitkiler elde edilmektedir. Böylece embriyo kültürü ile embriyo kurtarılmış olunur.
Yakın akraba olmayan başka bir türden bazı karakterlerin mevcut genotipe aktarılması gerekli olabilmektedir. Ancak bu durumda bazı problemler ortaya çıkmakta ve melez bitkiler elde edilememektedir. Melez bitki elde edilememesine seksüel uyuşmazlık veya oluşan melez embriyonun yaşama gücünün olmaması neden olmaktadır. Yakın akraba olmayan türler veya cinsler arası melezlemelerde melez embriyonun yaşam gücünün olmamasının bazı genetik faktörlerden kaynaklandığına inanılmaktadır. Farklı çavdar, buğday, arpa hatlarının ana olarak ve Agropyron repens (L.), Alopecurus agrestis, Lolium perenne, Hordeum bulbosum ve mısırın baba olarak kullanıldığı melezlemelerde oluşan melez embriyoların genomik uyuşmazlıktan ötürü endosperm gelişmesi normal olmamaktadır.
Bu durumlarda melez embriyo İn vitro koşullarında uygun besin ortamlarında kültüre alınarak normal gelişmesinin tamamlaması ve melez bitki elde edilmesi mümkün olmaktadır. Bu teknik ilk defa 1925 yılında Laibach tarafından Lolium perenne X L. acustriacum melezlemesinde başarı ile kullanılmıştır. Bu tekniğin başarısı; genotipe, embriyonun yumurtalıktan zarar görmeden izole edilmesine, ana bitkinin yetişme koşullarına ve besi ortamının bileşimine bağlıdır.
Embriyo kültürü; biyolojik temel çalışmalarda, tohumun çimlenememesi durumunda, ıslah süresini kısaltmada, yaşayamayan embriyoların kurtarılmasında, haploid bitkilerin üretilmesinde, tohum canlılığının hızlı test edilmesinde ve ender bitkilerin çoğaltılmasında kullanılır.
Bu kullanım alanlarından yalnızca doğrudan bitki ıslahı üzerinde etkisi olanlar açıklanacaktır.
4.1.1. Islah Süresini kısaltmada:
Bazı türlerde tohumların uzun olgunlaşma süreleri ve dormansi periyotları nedeniyle ıslah çalışmaları uzamaktadır. Dormansiye sebep olan faktörler, tohum kabuğu, endospermdeki endogen inhibitörler, düşük sıcaklık ve özel ışık gereksinimleri gibi faktörler ise bunlar çeşitli uygulamalarla giderilir. Sert tohum kabuğu nedeniyle çimlenmenin geciktiği durumlarda da çimlenme hızlandırılabilmektedir. Örnek olarak soya ve ayçiçeğinde tohum olgunluğu dönemi yaşam çemberinin %50 - 60 ını almaktadır. Ayçiçeğinin 10 günlük olgunlaşmamış embriyolarının in vitro kültürü yolu ile yaşam çemberi yarıya indirilebilmiştir.
Böylece ıslah çalışmalarında zaman kazanılarak çalışmanın daha kısa sürede ve daha etkin bir şekilde yürütülmesi sağlanır.
4.1.2. Haploid Bitkilerin Üretilmesinde
Uzak türler arası veya cinsler arası melezlemelerde döllenmeden sonra melez embriyonun gelişmesi sırasında ebeveynlerden birine ait kromozomların eliminasyonu ile haploidler üretilmektedir. Örneğin Hordeum vulgare X H. bulbosum melezinde döllenme kolayca olur, fakat H. bulbosum un kromozomları embriyogenesisin ilk birkaç bölünmesi süresince kaybolur. Bu nedenle gelişen bitkiler haploid vulgare bitkileridir. Vulgare bitkilerinin embriyoları izole edilerek kültür ortamına alınır. Bitkicikler elde edildikten sonra bunların kromozom sayıları kolçisin uygulanması gibi uygulamalar ile iki katına çıkarılarak double haploid bitkiler, bunlardan da double haploid hatlar elde edilir.
4.1.3. Ender Bitkilerin Çoğaltılmasında
Nadir bir şekilde bulunan veya yok olmak üzere olan bitkilerden embriyo kültürü yoluyla çok sayıda bitki elde edilerek bunlardan ıslah çalışmalarında yaralanılabilir. Örneğin, ticari muzun yabani akrabası olan Musa balbisinana tohumları doğada çimlenememektedir. Bununla birlikte fideler embriyonun kültüre alınmasıyla kolaylıkla elde edilebilmektedir. Bazı Hindistan cevizi çeşitlerinde de sıvı endosperm yerine yumuşak ve yağlı bir doku gelişmektedir. Bu tip Hindistan cevizleri makapuno olarak adlandırılır ve bunların tohumları normal koşullar altında çimlenmekte başarısız olmaktadır. Yine embriyo tekniği kullanılarak yetiştirilebilmektedir.
4.2. Haploid Bitki Üretimi
Somatik hücrelerindeki kromozom sayısı, ait oldukları bitki türünün gamet hücrelerinde bulunan kromozom sayısı kadar olan bitkilere Haploid bitkiler denir. Haploidler, her bir lokustaki allellerden sadece bir seriyi içermekte ve bu özellikleri ile ıslah çalışmalarında önemli yer tutmaktadır.
1. Haploidleri kullanmanın en başta gelen avantajı, tam bir homozigotluğu çok kısa sürede elde etme olanağını sunmasıdır. Dihaploid hatların kullanılmasıyla genetik ve ıslah çalışmalarını yapmak kolaylaşmakta ve sonuca daha çabuk ulaşılabilmektedir. Yabancı döllenen türlerde heterozigot oranı çok yüksek olduğundan bunlarda homozigot hatların elde edilmesi için 1-12 generasyon boyunca kendilemeler yapmak gerekmekte; kendine döllenen türlerde bile aynı amaçla 5-7 generasyon kendilenme işlemine gereksinim duyulmaktadır. Dihaplodizasyon yöntemi devreye girdiğinde homozigot hatlara 1 generasyonda ulaşılmaktadır.
2. Fı hibrit çeşitlerinin geliştirilmesinde homozigot hatlar arasında üstün kombinasyon yeteneği verenlerin belirlenmesi yöntemi kullanıldığından, hoploidinin hibrit çeşit ıslahında özel bir önemi bulunur. Dihaploid bitkilerden elde edilen saf hatlar Fı hibrit çeşit ıslahında ebeveyn olarak kullanılabilirler.
3. Kombinasyon ıslahında da sonuca çok kısa sürede ulaşmayı sağlayan haploidi sayesinde, Fı kademesindeki melez bitkilerden haploid çekerek farklı genotiplerde bulunan ve tek bir genotipte toplanması arzu edilen özelliklere sahip bitkiler kazanmak mümkündür.
4. Haplodizasyon, resesif mutasyonların açığa çıkarılmasında başvurulan en etkin yöntemdir. Haploid bitkilerde resesif genler, dominant genler tarafından örtülemeyeceğinden, mutlak homozigotiye sahip olan dihaploid hatlarda genetik açılımı izlemek basit bir işlem haline gelmektedir.
5. Haploid bitkiler, somatik hibridizasyon işleminin diploid protoplastlara göre daha kolay yapılabilmesine olanak tanımaktadır. Ayrıca iki haploid protoplastın birleşmesinin sonucu diploid olacağından; protoplast kültürü kullanılarak yapılan somatik hibridizasyon tekniğinin bilinen dezavantajlarının büyük bir kısmı böylece ortadan kalkacaktır.
6.Tetraploid türlerde, diploid bitkilerin üretiminde kullanılır.
7. Kendilemenin olanaksız olduğu bazı türlerde haploid uyartımı ve bunu takip eden kromozom katlamasıyla saf erkek bitkiler elde etmek mümkündür.
8. Farklı patojenler ve patojenlerin fizyolojik ırklarına karşı in vitro seviyede seçime olanak vermekte, hastalıklara dayanıklılık çalışmalarında zaman, yer ve maddi kazanç sağlamaktadır.
9. Güncel uygulamalarından biri de gen haritalarının çıkarılmasında kullanımlarıdır. Dihaploid hatlardan oluşan bir populasyonda, heterozigotluk nedeniyle ortaya çıkan intermediyer ekspresyonlara rastlanmaz. Bu nedenle de işaretleyicilerin (markör) tanımlanması çok daha etkin olabilmektedir. DH hatlarda herhangi bir gen, ister bitki isterse markör seviyesinde olsun 1:1 oranında açılacaktır. Bu durum özellikle poligenik olarak kontrol edilen bir karakterin (kümülatif karakterlerin) haritası çıkarılıyorsa önem taşımakta ve kolaylık sağlamaktadır.
Haploid Bitkilerin Elde edilmesinde kullanılan tekniklerden bazıları
1-Anter Kültürü
2-Ovül Kültürü
3-Kromozom Eleminasyonudur.
info@paulowniaci.com
|
